Adapters

En esta carpeta está vacia porque fastp detecta los adaptadores automaticamente, por lo cual no había necesidad de descargarlos de internet.

Data

Aquí tenemos nuestros datos crudos de las muestras, así como los metadastos de estas.

• metadata.tsv : Son los metadatos

• raw : Aqui van los fastqs de las muestras sin procesar.

DEG_output

Aquí se encuentra la información de los genes diferencialmente expresados. Para hacerlo, nf-core uso DESeq2.

• deseq2.pca.vals.txt`: Son los valores asignados en el PCA a cada muestra.

• deseq2.plots.pdf`: Aquí encontramos las gráficas creadas por deseq2 en donde se hacen PCAs de las muestras en donde se toman en cuenta los 500 genes más importantes, y con todos los genes. También encontramos un heatmap de las distancias euclideanas entre las muestras según los genes diferencialmente expresados.

• deseq2.sample.dists.txt`: Aquí estan las distancias euclideanas entre muestras.

• deseq2.dds.RData`: Este es un objeto de deseq que usamos el el análisis diferencial.

• size_factors`: Esta es una carpeta donde se encuentran los pesos de cada muestra para que la diferencia en reads no afecte el análisis diferencial. Ref: https://www.biostars.org/p/359060/

quality1

Aquí estan los fastqc de las muestras crudas, sin procesar. Hay un fastqc.html y un fastqc.zip por muestra, y un multiqc que abarca todas las muestras.

• Lo que no salió del pipeline de nf-core rnaseq son los datos de multiqc, esos fueron creados por nosotros aparte.

quality2

Aquí estan los fastqc de las muestras procesadas con fastp. Hay un fastqc.html y un fastqc.zip por muestra, y un multiqc que abarca todas las muestras. Es importante mencionar que estos fastqc salieron del pipeline de nf-core rnaseq, y aparte que nuestras muestras crudas parecian no tener adaptadores.

• Lo que no salió del pipeline de nf-core rnaseq son los datos de multiqc, esos fueron creados por nosotros aparte.

reference

En esta carpeta cargamos el archivo GTF del genoma humanohg38.fa, de ensembl. También añadimos la ruta al fasta del genoma humano.

results

Esta es una carepta muy amplia, que contiene todos los outputs del pipeline de nf-core rnaseq. Se explicará cada output bervemente a continuación:

SALMON_index

Esta carpeta tiene el index formado por salmon.

SALMON_output

Esta carpeta contiene los salmon.merged.* de la carpeta star_salmon (Equipo1/results/star_salmon), así como las carpetas en ese mismo sitio por cada muestra (que ya se mencionó anteriormente que es información proveniente de Salmon).

scripts

La carpeta de scripts contiene uestros jobs, los out_logs de los jobs, los scripts de R, el directorio del caché del pipeline, la importante carpeta work y el samplesheet.

• Equipo1/scripts/jobs`: Contienen los jobs que hicimos para nuestro RNA-seq:

  • Equipo1/scripts/jobs/download_data.sge`: Este job es el que usamos para descargar nuestros datos

    #!/bin/bash
    # Use current working directory
    #$ -cwd
    #
    # Join stdout and stderr
    #$ -j y
    #
    # Run job through bash shell
    #$ -S /bin/bash
    #
    #You can edit the scriptsince this line
    #
    # Your job name
    #$ -N Download_data
    #
    # Send an email after the job has finished
    #$ -m e
    #$ -M jasvpj@gmail.com
    #
    # If modules are needed, source modules environment (Do not delete the next line):
    . /etc/profile.d/modules.sh
    #
    # Add any modules you might require:
    # Write your commands in the next line
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/002/SRR7959202/SRR7959202.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/001/SRR7959221/SRR7959221.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/004/SRR7959194/SRR7959194.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/008/SRR7959218/SRR7959218.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/007/SRR7959197/SRR7959197.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/005/SRR7959215/SRR7959215.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/002/SRR7959212/SRR7959212.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/008/SRR7959208/SRR7959208.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/001/SRR7959191/SRR7959191.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/006/SRR7959206/SRR7959206.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/003/SRR7959193/SRR7959193.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/004/SRR7959214/SRR7959214.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/008/SRR7959198/SRR7959198.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/001/SRR7959201/SRR7959201.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/000/SRR7959220/SRR7959220.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/009/SRR7959209/SRR7959209.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/005/SRR7959205/SRR7959205.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/000/SRR7959190/SRR7959190.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/001/SRR7959211/SRR7959211.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/003/SRR7959213/SRR7959213.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/006/SRR7959216/SRR7959216.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/004/SRR7959204/SRR7959204.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/009/SRR7959189/SRR7959189.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/009/SRR7959219/SRR7959219.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/000/SRR7959210/SRR7959210.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/003/SRR7959203/SRR7959203.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/007/SRR7959217/SRR7959217.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/005/SRR7959195/SRR7959195.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/006/SRR7959196/SRR7959196.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/000/SRR7959200/SRR7959200.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/002/SRR7959222/SRR7959222.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/009/SRR7959199/SRR7959199.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/002/SRR7959192/SRR7959192.fastq.gz
    wget -nc ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR795/007/SRR7959207/SRR7959207.fastq.gz

    • wget: Es una función que sirve para descargar cosas de la web.

  • Equipo1/scripts/jobs/nextflow_rna_seq_fastp.sge`: Este es el job principal. Es el que usamos para dar las opciones de nextflow y correr el pipeline.

    #!/bin/bash
    # Use current working directory
    #$ -cwd
    #
    # Join stdout and stderr
    #$ -j y
    #
    # Run job through bash shell
    #$ -S /bin/bash
    #
    #You can edit the scriptsince this line
    #
    # Your job name
    #$ -N nextflow_test1
    #
    # I'm adding sonic speed to my job :) (We need it for this code to run)
    #$ -l vf=120G
    #$ -pe openmp 5
    # Send an email after the job has finished
    #$ -m e
    #$ -M ghobibohg@gmail.com
    #
    # If modules are needed, source modules environment (Do not delete the next line):
    . /etc/profile.d/modules.sh
    #
    # Add any modules you might require:
    module load nextflow/23.10.0
    module load singularity/3.7.0
    #
    # Write your commands in the next line
    
    export NXF_SINGULARITY_CACHEDIR="/mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/script/cache/.singularitynxf"
    export SINGULARITY_CACHEDIR="/mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/script/cache/.singularity"
    export NXF_HOME="/mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/script/cache/.nextflow"
    export SINGULARITY_TMPDIR="/mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/script/cache/.singularitytmp"
    export NXF_WORK="/mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/script/cache/otro_cache/.work"
    
    nextflow run nf-core/rnaseq -r 3.14.0 \
        -profile singularity \
         -work-dir /mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/scripts/work \
          --input /mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/scripts/samplesheet.csv \
            --outdir /mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/Equipo1/results \
              --max_memory '120.GB' \
                --max_cpus 5 \
                  --fasta /mnt/Archives/genome/human/GRCh38/ensembl76/chromosomes/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
                      --gtf /mnt/Archives/genome/human/GRCh38/ensembl76/GTF-file/Homo_sapiens.GRCh38.76.gtf \
                        --trimmer fastp \
                          --extra_fastp_args '--cut_front 20' \
                            --aligner star_salmon

  • • -r 3.14.0: Esta opción la usamos para definir la versión de nf-core rnaseq a usar. En nuestro caso, usamos la versión 3.14.0 porque la versión de nextflow más reciente en el cluster es las 23.10,.0 y la versión de nf-core rnaseq más reciente (3.18.0) ocupa la versión 24.10.0 de nextflow.

    • -profile singularity: Usamos esta opción para usar el enviorment de singularity, ya que es mucho más fácil usar esto que cargar todos los programas necesarios en el cluster.

    • -work-dir: Esta opción define donde se va a hacer la carepta work.

    • –input: En este parametro se tiene que poner la samplesheet. La samplesheet contiene la ruta a todas las muestras, y también otras cosas que se explicaran es su sección dedicada.

    • –outdir: Este parametro define la ruta donde se alojaran todos los outputs del pipeline. En este caso, es en nuestra carpeta de results.

    • –max_memory: Esta opción nos permite limitar el uso de memoria del pipeline. En este caso es importante porque tenemos 34 muestras humanas, lo cual es muy demandante y el cluster tiene un limite de asignación de memoria RAM. Nosotros observamos que este limite era de 120 GB.

    • –max_cpus: Esta opción nos permite limitar el uso de cpus. Es un caso igual al anteriori y por lo tanto usamos solo 5 cores.

    • –fasta: En este parametro tenemos que poner el directorio donde se encuentra el genoma de referencia humano.

    • –gtf: En este parametro se pone la dirección del archivo GTF del genoma de referencia humano elegido.

    • –trimmer: En esta opción definimos el trimmer a usar. Podemos elegir entre fastp o trimgalore. En nuestro caso elegimos fastp porque es mucho más rápido y aparte es capaz de autodetectar los adaptadores

    • –aligner: Esta opción sirve para definir el alineador a usar. En este caso usamos STAR/salmon

    Por último, definimos los directorios de los caches para no llenar nuestro usuario del cluster.

• Equipo1/scripts/out_logs`: En esta carpeta están los out logs (procesamiento en vivo) de nuestros 2 jobs.

• Equipo1/scripts/r_scripts`:

• Equipo1/scripts/cache`: Esta carpeta es importante porque es donde se aloja el caché formado por el pipeline. En caso de no existir, nuestro usuario del cluster se llenaría con el caché del pipeline porque es la ruta predeterminada.

• Equipo1/scripts/work`: Esta carpeta es como el corazón de todo el pipeline, porque es en esta carpeta donde se hacen los directorios dedicados a cada proceso.

• Equipo1/scripts/samplesheet.csv`: Este archivo es el input del pipeline de nf-core rnaseq. La formamos poniendo el directorio hacia cada muestra cruda, poniendo si es Single end o paired end, el nombre de la muestra y su strandedness.

STAR_index

En esta carpeta se ubica el index usado en el alineamiento de STAR.

STAR_output

El output de star es justo los muestra.bam y muestra.bam.bai que se encuentran en la carpeta star_salmon (Equipo1/results/star_salmon)

TRIM_results

En esta carpeta se encuentran los fastqs procesados por fastp, con la forma muestra.fastp.fastq.gz.

Secuencias Crudas

Secuencias Procesadas